細胞攻略 | A-549(人肺腺癌細胞)細胞培養教程

細 胞 基 本 信 息

▼細胞正常生長形態照片

細胞名稱:  A-549(人肺腺癌細胞)

細胞別稱:  A 549; A549; NCI-A549; A549/ATCC; A549 ATCC; A549ATCC; hA549

細胞貨號:  SNL-089

生長特性:  貼壁

培養條件:  DMEM+10% FBS+1% P/S

培養環境：空氣，95%；二氧化碳 (CO2)，5%

細胞簡介：A-549細胞是于1972年由D.J.Giard等人通過從一名58歲白人男性的肺癌組織中進行外植體培養而建立的，角蛋白呈陽性。M.Lieber等人的研究表明，A549細胞可以利用胞苷二磷酸膽堿途徑合成富含不飽和脂肪酸的卵磷脂。A-549細胞可用于癌癥、免疫腫瘤學和毒理學研究，也是一種合適的轉染宿主。

A-549(人肺腺癌細胞)特點

01細胞顆粒感較重

細胞傳代培養時細胞內黑點及細胞外顆粒較多，建議使用優質血清及培養基培養細胞；

02傳代、復蘇注意細胞狀態

細胞消化或者復蘇操作不當容易導致細胞死亡裂解產生大量碎片及顆粒，進而影響活細胞狀態，注意消化或復蘇過程盡量輕柔，嚴格控制消化時間和復蘇操作規范，傳代或復蘇24h后建議觀察細胞，建議換液一次去除死亡細胞；

細 胞 收 貨 攻 略

常溫細胞

1、T25瓶收貨后，拆開外包裝，用75%酒精消毒T25瓶表面，放37℃培養箱靜置2-4h；

2、吸走大部分培養基并留10-12 ml，顯微鏡下拍照保存細胞狀態照片，觀察細胞密度，若細胞密度大于80%即可按比例傳代（傳代比例建議1：2），若細胞密度低于70%可以留10-12 ml繼續培養至細胞密度80%以上再進行傳代培養；

凍存細胞

1、細胞收貨后盡快開箱檢查，若干冰充足可以取出細胞迅速置于-80℃冰箱（2-3天內復蘇）短期保存或液氮中長期保存，若干冰揮發建議立即復蘇細胞并聯系銷售人員解決；

2、凍存細胞建議盡快復蘇一管培養檢查，以免超出售后期，復蘇步驟參考復蘇攻略；

3、復蘇一管細胞出現異常及時聯系銷售人員，在專業技術支持的指導下進行下一步操作；

Tips：

1.細胞收貨出現漏液、培養瓶破損、干冰揮發等異常情況時，及時拍照聯系銷售人員；

2.該細胞貼壁生長，一般T25瓶運輸過程中較少出現大量細胞脫落并聚團的情況，少量細胞脫落是正常狀態，不影響細胞生長，按正常操作步驟繼續培養即可。

3.尚恩生物T25瓶發貨的細胞內含對應細胞的培養基，可以收集原裝培養瓶內培養基經1500rpm離心5min后，取上清于4℃保存用于后續細胞培養；

細 胞 傳 代 攻 略

1、先盡量吸干凈T25瓶原培養基，再加3-4ml 常溫PBS輕輕潤洗細胞10-20s，吸走潤洗的PBS；

2、T25瓶加1ml左右胰酶，輕輕晃動培養瓶以使胰酶鋪勻瓶底細胞層，將培養瓶放入37度培養箱消化；

3、消化到細胞間隙變大，但未脫落時加2-3ml培養基終止胰酶消化；

4、 混勻細胞，900rpm離心3-5min，棄上清；

5、加新的培養基輕輕重懸細胞，均勻分到新的培養瓶里，補足培養基，將培養瓶放回培養箱靜置培養；

Tips：

1. 對于消化細胞程度，客戶如果經驗不多，無法準確掌控胰酶作用時間，建議客戶按照下述操作：胰酶首先復溫到室溫后加入細胞，放入37度培養箱，然后每隔30秒，即吹打下細胞（此時吹打細胞應盡量輕柔，不能強行將細胞吹下，否則細胞可能出現機械損傷），如果能夠吹打散細胞，說明細胞消化完成可以終止消化，如果30秒吹打不下，再等30秒重復操作直至能夠輕柔的吹下細胞；

2. T25瓶加10-12ml培養基，10cm皿加12-15ml，2-3天換液一次。

3. 細胞收貨后傳代建議按1：2傳代，后續培養可以視具體細胞生長狀態和密度情況決定傳代比例；

4. 傳代后24h建議觀察細胞并換液一次去除死亡細胞；

細 胞 凍 存 攻 略

凍存步驟

1、先將細胞按傳代步驟消化、離心，至傳代步驟4，棄細胞上清，獲得細胞沉淀；

2、加入適量預先配好的程序性凍存液輕輕重懸細胞，并將細胞懸液轉移至做好標記的凍存管中；

3、將凍存管放入程序性凍存盒，放入-80℃冰箱過夜；

4、轉移細胞至液氮保存并登記細胞保存位置，液氮保存24h后建議復蘇一管檢測凍存細胞的活性，若活性合格即可長期保存，若低于80%建議重新凍存；

Tips：

1.檢測凍存細胞活性結果未合格前，培養瓶內細胞建議繼續培養直至確認凍存合格方可視需要丟棄；

2.程序性凍存液需要配合程序性凍存盒使用，若使用非程序凍存液可以按產品說明書處理降溫過程；

3.T25培養瓶長滿通常可以凍存2-3管，10cm皿長滿可以凍存3-4管；

細 胞 復 蘇 攻 略

復蘇步驟

1、將所需的培養基放在培養箱預熱30min后開始復蘇；

2、準備37度溫水，將細胞從液氮罐取中出，觀察管內無液氮的情況下，捏住管蓋，將細胞凍存部分浸入溫水輕輕搖晃，融化至米粒大小冰塊，終止水浴；

3、離心完成后，棄凍存液，用剛才預熱的培養基緩慢加入凍存管，并輕柔重懸細胞后接種至T25或者10cm皿中。

Tips：

1.凍存管在液氮長期保存過程中難免滲入液氮，取出細胞時震動不要過大，水浴前一定要觀察管內是否存在液氮，若有液氮建議靜置一會待液氮蒸發后再水浴；

2.水浴時可以使用一次性PE手套包住凍存管避免直接接觸水源，可以降低管蓋縫隙滲入水導致污染的概率；

3.水浴至剩米粒大小時及時終止水浴，避免過度水浴或水浴時間不足；

4.建議水浴完成后直接在離心管內離心細胞，避免再次轉移細胞；

5.復蘇后的細胞比較脆弱，吹打和轉移細胞時盡量輕柔，復蘇24h后換液去除死亡細胞；

常見問題及解決方案

01

細胞密度怎么計算的？

嚴格意義上，細胞密度需要收集細胞懸液計數細胞數量，但在實際培養過程中，并不需要為了精確控制細胞數量而消化細胞計數。因此，常用的細胞密度指細胞相對于最大生長密度的比值，貼壁細胞可以粗略的用細胞所占培養容器底面積百分比表示，即顯微鏡下觀察培養容器底部，有細胞的區域占總區域的百分比值，當然這種表達方式受限于單個細胞生長不同密度時所占面積不同導致并不嚴謹，但也是相當直觀、簡便的表現細胞狀態的一種方式；

02

培養過程中細胞碎片較多怎么處理？

1.細胞內的黑色顆粒是細胞外分泌泡及細胞器折光，這個屬于細胞自身特性，無法清除也無法改變，大部分細胞都會有這種現象，只是不同細胞顆粒多少有區別，細胞培養體系不適應、營養缺乏、滲透壓異常等均可能導致細胞內顆粒增加，建議使用合適的培養條件。

2. 細胞外的黑色顆粒大部分是細胞碎片和細胞代謝產物，可以先吸走培養基后用PBS潤洗清除，再加新的培養基繼續培養。潤洗不能清除的可以換液清洗后等細胞密度70-80%左右消化處理細胞，消化完成后加培養基終止消化，混勻細胞，收集細胞懸液900-1000rpm(約150g)離心3min，棄上清。再加5ml PBS重懸細胞，再離心后，用培養基重懸接種到新的培養皿。第二次PBS重懸是為了去除碎片，如果平時碎片比較少，傳代時可以省略PBS重懸的步驟；如果碎片很多，建議PBS多洗幾次。

03

培細胞具體消化時間是多久？

每個客戶用的胰酶活力及消化步驟、試劑都是不一樣的，不能規定消化時間，以實際消化效果和客戶經驗為準。 

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