小鼠心肌細(xì)胞的分離、純化和培養(yǎng)

　　小鼠心肌細(xì)胞的培養(yǎng)方法，可評價心肌細(xì)胞的存活狀況并鑒定心肌細(xì)胞純度。方法應(yīng)用胰酶聯(lián)合膠原酶共同消化3d內(nèi)C57乳小鼠心臟，臺盼藍(lán)染色判斷心肌細(xì)胞存活率，α－actin免疫熒光染色鑒定心肌細(xì)胞純度。結(jié)果利用3d內(nèi)乳鼠心臟可成功培養(yǎng)原代小鼠心肌細(xì)胞，臺盼藍(lán)染色顯示細(xì)胞存活率大于95%，α－actin免疫熒光染色顯示心肌細(xì)胞純度達(dá)95%以上。結(jié)論嚴(yán)格控制實驗條件，可成功培養(yǎng)高存活率和高純度的小鼠心肌細(xì)胞。

　　小鼠心肌細(xì)胞的分離、純化和培養(yǎng)：

　　心肌組織的分離：取出生0～3d的乳小鼠20只，浸泡于75%的酒精中8～10s消毒后迅速送入超凈工作臺，將其固定于無菌泡沫板上，用眼科剪將乳小鼠胸骨正中偏左的皮膚剪開，用鑷子分離皮膚，充分暴露胸部，換另一把眼科剪做一縱向切口打開胸腔，盡量不要超出剪開的皮膚范圍，忌打開腹腔，以免引起污染，根據(jù)心臟的搏動，順勢將心臟擠出。

　　取心臟放入冰冷的PBS緩沖液中吹打清洗，盡量將紅細(xì)胞清洗干凈，用眼科鑷輔助眼科剪將多余的心房及周圍肺組織等去除，隨后將心臟移到另一個干凈的培養(yǎng)皿，將心臟剪裂2～3下（裂而不斷的程度即可），共清洗3遍。

　　心肌細(xì)胞的分離與培養(yǎng)：將心臟組織吸入玻璃培養(yǎng)瓶中，加入0.25%胰酶（含EDTA）10mL，靜置，4°C過夜（12～16h）。第2天，取出過夜的心臟組織，加入*培養(yǎng)液10mL，37°C恒溫水浴5min，中止胰酶的消化作用；棄去上清液，加入膠原消化液10mL（注意棄上清液時勿把心臟組織吸走）。置于37°C的恒溫水浴箱，1min用手輕搖。棄上清液，將心臟組織移入另一個培養(yǎng)瓶中加入12mL膠原消化液，置于37°C恒溫水浴箱上，用手輕搖30min，將上清液移入新的離心管中。重復(fù)消化3～4次，僅見絮狀樣物質(zhì)即心肌組織消化*。

　　將收集的上清液離心1000r/min5min，棄上清液，加*培養(yǎng)液30mL，輕輕拍打管壁使得細(xì)胞懸浮于其中，隨后接種在100mm培養(yǎng)皿中，放于37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育70min，差速貼壁以除去成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等非心肌細(xì)胞。輕輕吸出細(xì)胞懸液，臺盼藍(lán)染液染色計數(shù)，根據(jù)不同的實驗?zāi)康挠?培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度，加入BrdU使其在培養(yǎng)液的終濃度為0.1mmol/L，輕輕混勻后，將其接種到在事先用多聚賴氨酸預(yù)包被處理過的6孔板中，37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育48h后，換無BrdU的*培養(yǎng)基，以后每隔48h換液1次。